做座高速逆流色谱在天然产物分离中的应用

高速逆流色谱在天然产物分离中的应用

摘要：综述了高速逆流色谱在天然产物有效成分分离中的新应用。

关键词：高速逆流色谱；天然产物；分离；综述

中图分类号：R944.9 文献标识码：A 文章编号：(2005)

高速逆流色谱( high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的色谱法。逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱到现在的HSCCC 历程数十年，技术和设备日臻成熟，广泛应用于中药及天然药物的研发。本文综述了HSCCC 在天然产物分离中的新应用。

1 HSCCC的原理和特点

HSCCC 的流动相、固定相均为液体，且互不相溶。利用螺旋柱运动时产生的离心力，使两相溶剂系统不断混合。固定相保留在聚四氟乙烯管中，利用恒流泵连续输入流动相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相间持续分配，按分配系数大小被先后洗脱。

HSCCC 有几个突出优点：( 1) 无不可逆吸附。聚四氟乙烯管中的固定相无需载体，为液- 液色谱系统，故而消除了气- 液和固- 液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，特别适于分离极性物质和生物活性物质；( 2) 高回收率。由于流动相和固定相均为液体，样品可全部回收，分离纯化与制备可同

步完成，故特别适于制备性分离；( 3 ) 操作简便。

因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷。与HPLC 相比，HSCCC 进样量较大，最多可达数克，是H P L C 的数百倍；与常压、低压色谱相比，HSCCC 的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1 个甚至多个单体，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98％以上。分离效果主要与溶剂体系的选择和旋转速度、样品制备、洗脱方法等有关。

2 分离植物有效成分

2.1 生物碱类

生物碱是重要的天然含氮化合物，对疾病治疗和药物发展等具有重要作用。生物碱在植物中分布非常广泛，至少有50多科120属植物中含有生物碱。近年，用HSCCC 已成功分离了多种利好铜铝锌相干资源类公司；同时生物碱。

黄连是重要的中草药，具有抗氧化作用，可治疗头晕、风湿及疲劳等。黄连中主要的生物活性物质包括巴马亭、小檗碱、表小檗碱和黄连碱等。Yang等[1]以氯仿- 甲醇-0.2mol/L 盐酸(4∶1.5∶20)为两相溶剂，利用HSCCC分离得上述4 种生物碱。紫杉醇为抗癌药物，属于二萜类生物碱，碱性极弱，Chiou等[2]采用正己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 乙醇- 水(5∶7∶5 ∶1 ∶6 . 5 ) 五元体系分离了紫杉醇和类似物caphalomannine。其它生物碱分离实例[3～10]见表1。

2.2 黄酮类

黄酮类化合物多存在于高等植物和羊齿类植物中，常以游离或与糖成苷的形式存在，在花、叶、果实等组织中多为苷类，而在木重要最简略有用的避免液压成型机生锈的方法就是给压力机机械涂改防氧化油漆质部组织中多为游离苷元。主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶精、花色素等及各种衍生物。

黄芪具有抗疲劳、免疫刺激和强心等功效。药理和临床实验表明，黄芪中的异黄酮类具有杀菌和清除超氧化阴离子的活性。Ma 等[11]利用HSCCC，以乙酸乙酯- 甲醇- 乙酸- 水( 4∶1 ∶0.25∶5) 为溶剂系统，从黄芪粗提物中出分离出两种异黄酮，纯度均大于95％。Du 等[12]利用正己烷- 乙酸乙酯-正丁醇- 甲醇- 乙酸- 水( 1 ∶2 ∶1 ∶1 ∶5 ∶1 ) 从大豆中分离出4 种异黄酮，纯度均大于90 ％。其他不同植物中黄酮类成分的分离实例见表2。

2.3 蒽醌类

蒽醌类化合物是广泛存在的重要天然色素，尤其在高等植物和真菌、地衣等低等植物中更为普遍。袁黎明等[21]利用HSCCC 对传统中药大黄中的蒽醌类活性成分进行了制备性分离研究，采用氯仿- 甲醇- 水( 4∶3.8∶2) 溶剂系统，分离效果良好。Yang 等[22]利用乙醚- 水的两相溶剂系统，通过调整流动相pH 值，采用梯度洗脱，从大黄中分离了大黄酚、大黄素、大黄素甲醚等羟基蒽醌类化合物，纯度均大于98％。此外，采用氯仿- 甲醇-丙酮- 水( 9∶8∶1∶8) 分离芦荟中的蒽醌类物质，得到纯度为95.7％的芦荟大黄素和98.9％的芦荟大黄素甙[ 23] 。

2.4 酚类和脂肪酸类

HSCCC对酚类和脂肪酸类物质也有良好的分离效果。丹参的药用有效成分主要为丹参酮类和丹参酚酸，近年的研究多集中于后者。丹参酚酸是水溶性酚类化合物，具有抑制动脉血管内皮舒张、降血压和保护肝脏等活性。Li等[24]采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇- 水( 3 ∶7 ∶1 ∶9 ) 为溶剂系统，利用HSCCC从丹参粗提物500mg中得到纯度大于98％的丹参酚酸B 342mg。Tian 等[25]则从山茱萸的正丁醇提取物中，以乙酸乙酯- 正丁醇- 水(5∶1.8∶6)与乙酸乙酯- 乙醇- 水( 5∶0.5∶6) 两步分离得到没食子酸，纯度大于9 7 ％。

3 从微生物和藻类中提取有效成分

类胡萝卜素主要来自高等植物和藻类，具有抗癌、抑制溃疡、防治心脏病等功效，其在藻类中可利用生物反应器大规模连续生产。虾青素是类胡萝卜素中抗氧化活性最强的物质，Li 等[26]利用HSCCC，采用正己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水( 5∶5∶6.5∶3)溶剂体系，经一步纯化，从粗品中分离出纯度大于97％的虾青素。此外，用正己烷- 乙醇- 水(4∶3∶1)可从微藻中分离出纯度为98％的叶黄素[27和需要获得更多的经验]。

红曲色素是以微生物法生产的天然食用色素，是红曲菌属真菌发酵粮食所得的代谢产物。目前结构已知的有红色素类、紫红色素类和黄色素类3种。夏明等[28]利用HSCCC，采用石油醚-甲醇-乙酸乙酯- 水( 3∶6∶5∶4) 为两相溶剂，成功分离了上述3 但其本钱会随着时间的流逝而增长种色素。

此外，Lu 等[29]用正己烷- 甲醇(2∶1)体系从微藻Thraustochytrium ATCC26185中分离得到纯度大于9 5 ％的鲨烯。

4 抗生素的分离纯化

抗生素的分离制备也可采用HSCCC，须注意以下几点[30]：(1)选择极性两相溶剂体系，保证有效组分能够充分溶解；( 2) 加入适量的疏水性有机溶剂，调整有效组分的分离系数；( 3) 溶剂体系中加入有机酸，使大部分有效组分进入有机相中；(4)采用低流速进样(0.5ml/min)。

Oka 等[31]采用正己烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水(3∶6∶5∶5) 分离得到纯度分别为98. 2％、92 .3 ％、97.4％的螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。Harada 等[ 30]采用正丁醇- 乙酸乙酯-0.005mol/L 三氟乙酸(1.25∶3.75∶5)的溶剂体系，从Lysobacter 发酵液分离的WAP-8294A混合物中分离得到了对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有较强抗性的WAP-8294 A2。

5 总结

HSCCC 是一种有独特优势的液相分配色谱技术。其溶剂系统更换灵活，能实现从微克量级的分离分析到克量级的分离制备；可用于天然产物粗提物的去除杂质和单个产物的精制；也可与质谱仪或红外光谱联用进行高纯度分析。HSCCC 有望在标准品的制备、天然产物化学成分研究及新药研发等领域得到更广泛的应用。

参考文献（略）(end)